Identificación y caracterización de la Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasa (NMNAT) en Trypanosoma cruzi: enzima clave en el metabolismo del NAD+

Trypanosoma cruzi es el causante de la enfermedad de Chagas. El aumento reciente de esta enfermedad, se debe en gran medida al desarrollo de resistencia por parte del parásito a las drogas comúnmente usadas contra este. Las NMNAT (EC: 2.7.7.1) catalizan un paso clave en la biosíntesis del NAD+. Dado que el NAD+ es fundamental para sostener procesos fisiológicos basales en T. cruzi, garantizar su supervivencia en el hospedero y contribuir a los mecanismos de resistencia a drogas, la identificación de la NMNAT de T. cruzi (TcNMNAT) es primordial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra la enfermedad de Chagas; partiendo del conocimiento de la bioquímica del parásito. En este estudio se buscaron secuencias candidato para la TcNMNAT mediante programas de alineamiento, usando las bases de datos TritrypDB y PDB. Se generaron modelos tridimensionales de la proteína correspondiente, y un mutante delecional de la misma, en el servidor I-TASSER. La secuencia identificada se amplificó y clonó en el vector de expresión pET-100. La proteína 6xHisTcNMNAT fue expresada en E. coli y purificada parcialmente empleando cromatografía de afinidad. De esta proteína se confirmó su actividad enzimática y se determinaron sus constantes cinéticas correspondientes; todo esto mediante ensayos enzimáticos directos empleando RPHPLC. En este trabajo se identificó un marco de lectura para una NMNAT en el genoma de T. cruzi, cuya proteína recombinante presenta actividad adenilil transferasa. Esto representa la primera identificación y caracterización cinética de una NMNAT en Trypanosoma cruzi; lo cual constituye un primer paso en la comprensión del metabolismo del NAD+ en este parásito, dando nuevos aportes al conocimiento del metabolismo del NAD+ en parásitos intracelulares.Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Increase in the incidence rates of such illness, is due to resistance by the parasite to commonly used drugs against it. The NMNAT (EC: 2.7.7.1) catalyze a key step in the biosynthesis of NAD+. Since NAD+ is essential for sustaining basal physiological processes in T. cruzi, ensuring its survival in the host, and also contributes to drug-resistance mechanisms, the identification of a T. cruzi NMNAT (TcNMNAT) becomes essential to develop new therapeutic strategies against Chagas disease; departing from a comprehensive knowledge of this parasite´s biochemistry. In the present study, TcNMNAT candidate sequences were searched by means of alignment programs and data bases such as TritrypDB and PDB. Three dimensional models of the resultant protein and its deletional mutant were generated by the server ITASSER. The identified candidate sequence was amplified and cloned into the expression vector pET-100; and the corresponding recombinant protein (6xHisTcNMNAT) was expressed in E. coli and partially purified using affinity chromatography. Enzymatic activity and the equivalent kinetic constants were determined for this protein, through direct enzymatic assays using RP- HPLC. In this project the ORF for an NMNAT was identified in the genome of T. cruzi and its recombinant protein shows adenylyltransferase activity, which represents the first identification and characterization of a NMNAT in Trypanosoma cruzi. This finding constitutes a first approach in the understanding of this parasite´s NAD+ metabolism, contributing also to the understanding of NAD+ metabolism in intracellular parasites.Maestrí

Search for new HCMV antigens with immunogenic potential for vaccine formulation

44 p.El citomegalovirus humano (HCMV) es un betaherpesvirus humano de tipo 5 (HHV5) con una alta prevalencia global y que supone un problema muy grave principalmente en personas inmunocomprometidas, como los pacientes con un trasplante de órgano sólido (TOS). Hasta la fecha a pesar de los múltiples esfuerzos, no se ha conseguido desarrollar una vacuna eficaz que impida la infección y propagación de este virus. Nuestro grupo identificó que el genoma de HCMV presenta 77 proteínas con dominios transmembrana, de las cuales muchas de ellas todavía se desconoce su función y que podrían estar involucradas en procesos tan importante como la entrada del virus o la modulación del sistema inmune. Estas proteínas de membrana podrían inducir la respuesta inmune humoral mediante la producción de anticuerpos neutralizantes (Nabs), por lo que podrían ser posibles candidatas para la formulación de una posible vacuna. En este trabajo, se evaluaron 9 proteínas, (6 transmembrana y 3 citosólicas) de las cuales algunas de ellas tienen un papel esencial en el ciclo replicativo viral o inmunomodulación. Para ello se utilizó la técnica de ELISA utilizando lisados transfectados con los antígenos de HCMV tanto en condiciones nativas como reductoras. Para ello, se utilizaron sueros de una cohorte de 12 pacientes con TOS de los cuales se disponía de un suero preinmunización y post-inmunización para determinar si había reconocimiento específico de estas proteínas. Los resultados indicaron que las proteínas más reconocidas fueron, UL44, UL57, UL75 y UL83, mientras que las menos reconocidas en ambas condiciones fueron US12, US30 y RL11. Pensamos que la técnica utilizada es válida para la búsqueda de proteínas de HCMV que puedan estimular la respuesta inmune de los pacientes, sin embargo, es necesario llevar a cabo estudios funcionales para determinar su posible actividad neutralizante o de estimulación de la respuesta celular.Human cytomegalovirus (HCMV) is a human betaherpesvirus of type 5 (HHV5) with high global prevalence and poses a serious problem mainly in immunocompromised individuals, such as patients undergoing solid organ transplantation (SOT). Despite multiple efforts, an effective vaccine to prevent HCMV infection and spread has not been developed to date. Our group identified that the HCMV genome encodes 77 proteins with transmembrane domains, many of which still have unknown functions and could be involved in important processes such as virus entry or immune system modulation. These membrane proteins could induce humoral immune response by producing neutralizing antibodies (Nabs), making them potential candidates for vaccine development. In this study, we evaluated 9 proteins (6 transmembrane and 3 cytosolic), some of which play an essential role in viral replicative cycle or immunomodulation. ELISA technique was used, employing lysates transfected with HCMV antigens under both native and reducing conditions. Sera from a cohort of 12 SOT patients, including pre-immunization and post-immunization samples, were used to determine specific recognition of these proteins. The results indicated that the most recognized proteins were UL44, UL57, UL75, and UL83, while the least recognized proteins under both conditions were US12, US30, and RL11. We believe that the technique used is valid for the identification of HCMV proteins that can stimulate the immune response in patients. However, functional studies are needed to determine their potential neutralizing activity or stimulation of cellular response.Máster Universitario en Microbiología Aplicada a la Salud Pública e Investigación en Enfermedades Infecciosas (M138

Estudio de factores proteicos asociados a la regulación de los genes HSP70 en Leishmania braziliensis

La leishmaniasis constituye un grupo de enfermedades producidas por parásitos protozoos pertenecientes al género Leishmania. Durante su ciclo de vida, el parásito alterna entre un vector invertebrado y un hospedero vertebrado, lo que le exige desarrollar cambios morfológicos y bioquímicos que le permitan sobrevivir y adaptarse al estrés celular que debe enfrentar en ambos hospederos. Adaptación que depende de la regulación de la expresión de una amplia variedad de genes, dentro de los cuales se encuentran los genes HSP70. Se ha demostrado que estos parásitos, tanto del subgénero Leishmania como del subgénero Viannia, poseen dos tipos de genes HSP70 (HSP70-I y II), los cuales se diferencian en su región 3´ no traducida (3´ UTR); diferencias relacionadas con los mecanismos moleculares de adaptación del parásito para tolerar el estrés térmico al que es sometido durante su ciclo de vida. Ensayos recientes, en L. braziliensis, han identificado proteínas con afinidad a las regiones UTR de los ARNm de estos genes, hallazgo de gran importancia teniendo en cuenta que la regulación de su expresión génica ocurre principalmente a nivel postranscripcional, y está mediada por la interacción entre elementos reguladores cis y trans del parásito. Entre las proteínas identificadas en dicho estudio se encuentran las proteínas LbrM.25.2210 (SCD6) y LbrM.30.3080 (RBP42), para las cuales, en esta Tesis, se estudiaron sus características moleculares y funcionales como factores proteicos implicados en la regulación génica en Leishmania. Inicialmente, se confirmó la capacidad de estas proteínas para interactuar de forma directa con moléculas de ARN. Observándose que estas proteínas son capaces de interactuar con un motivo con características de elemento ARE. Por otra parte, la interacción de estas proteínas con moléculas de ARN también fue demostrada in vivo, encontrándose asociados varios transcritos codificantes para proteínas relacionadas con el metabolismo y degradación celular. De forma particularmente destacable, asociada a la proteína RBP42 se identificó el transcrito correspondiente al gen HSP70-II. Así mismo, se encontraron asociaciones de las proteínas de estudio con transcritos codificantes para proteínas involucradas en la diferenciación y sobrevivencia del parásito en condiciones de choque térmico. Con el propósito de dilucidar los posibles procesos biológicos en los cuales podrían estar involucradas estas proteínas se determinó el interactoma de cada una de ellas. Cabe destacar que los interactomas comparten una alta proporción de proteínas, lo que sugiere algún tipo de relación funcional; de hecho, las dos proteínas forman parte de los interactomas recíprocos. Ambos interactomas están enriquecidos en proteínas asociadas a los procesos de traducción, metabolismo de ARN y regulación de la expresión génica. Como apoyo a un posible papel de estas proteínas en la regulación postranscripcional, cabe indicar que se encontraron varias proteínas cuyos homólogos han sido reportados como constituyentes de gránulos de ARN, principalmente cuerpos de procesamiento y gránulos de estrés. Finalmente, para analizar la función de SCD6 y RBP42 se generaron líneas mutantes de parásitos que sobreexpresan las proteínas fusión SCD6-mCherry y RBP42-mCherry. La línea sobreexpresante control (expresión de la proteína mCherry) de L. braziliensis pudo ser establecida, pero, por el contrario, las líneas de sobreexpresión para cada una de estas proteínas, luego de una semana de crecimiento, perdieron viabilidad. Estos resultados, si bien no concluyentes, sugieren que la sobreexpresión de SCD6 y RBP42 en L. braziliensis afecta negativamente al desarrollo y sobrevivencia del parásito. Como alternativa, se logró, generar estas líneas de sobreexpresión utilizando la especie L. major, lo que permitió determinar importantes implicaciones de estas proteínas en el desarrollo de los parásitos; observándose alteraciones morfológicas significativas y el retardo del crecimiento de los parásitos en condiciones fisiológicas de crecimiento, siendo el efecto mucho más pronunciado en condiciones de estrés térmico. Por otra parte, la capacidad infectiva in vitro de estos parásitos mutantes resulta significativamente afectada en relación con la cepa silvestre. En conjunto, este estudio aporta la caracterización de las proteínas SCD6 y RBP42 como proteínas de unión a ARN que, junto al resto de análisis complementarios sugieren su relevante implicación en la regulación de la estabilidad o degradación de un amplio grupo de transcritos en Leishmania.Pontificia Universidad JaverianaLeishmaniasis is a disease caused by protozoan parasites of the Leishmania genus. These parasites present a complex digenetic life cycle alternating between invertebrate and vertebrate hosts. Therefore, these parasites must develop morphological and biochemical changes that allow them to survive the host defense mechanisms and adapt to the intracellular environment within the human phagocytic cells. This adaptation depends on the regulation of a wide variety of genes, and the HSP70 genes are found among them. Parasites of Leishmania and Viannia subgenera present two types of HSP70 (HSP70-I and II) genes, which differ in their 3’ untranslated regions (3’ UTR); these differences would be related to the molecular mechanisms regulating the adaptation to the thermal stress that the parasite suffers through its life cycle. Recent assays in L. braziliensis have identified different proteins with affinity to the UTRs of these genes, results of great importance considering that the regulation of gene expression in these parasites occurs mainly at the posttranscriptional level, mediated by the interaction between cis and trans regulatory elements. Among the proteins identified, the LbrM.25.2210 (SCD6) and LbrM.30.3080 (RBP42) were the focus of this Thesis, in which their molecular and functional characterization was undertaken, considering their putative function as protein factors involved in the gene regulation in Leishmania. Initially, we confirmed the capacity of SCD6 and RBP42 proteins to directly interact with RNA molecules, particularly, with a RNA motif related to the ARE elements. On the other hand, the binding capacity of these proteins in vivo was also demonstrated, finding several transcripts associated to SCD6 and RBP42 proteins. Transcripts involved mainly in metabolism pathways and cellular proteolysis. Remarkably, the transcript corresponds to the HSP70-II gene was identified associated with the RBP42 protein. Likewise, transcripts involved in the differentiation and survival of the parasites in thermal stress conditions, were found associated both to SCD6 and RBP42 proteins. In order to elucidate the possible biological processes in which these proteins could be involved, the interactome of each protein was determined. Notably, the interactomes share a high proportion of proteins, suggesting some type of functional relationship; in fact, both proteins were identified in the reciprocal interactomes. The interactomes are enriched in proteins associated with translation, RNA metabolism and regulation of gene expression processes. In support of a possible role of SCD6 and RBP42 proteins in the post-transcriptional regulation was the finding of several proteins, whose homologues have been reported as constituents of RNA granules, mainly processing bodies and stress granules. Finally, to analyze the SCD6 and RBP42 function, overexpressing lines of parasites were generated. Initially, transfection assays using constructions expressing either SCD6 or RBP42 proteins, fused to the mCherry protein, were done in L. braziliensis parasites. Whereas the control parasite line (parasites that express the mCherry protein) was obtained, the parasites overexpressing SCD6 or RBP42, however, after one week of growth, lost their viability. These results, while not conclusive, could indicate that SCD6 and RBP42 overexpression, negatively affects the development and survival of the parasites. As an alternative, it was tried, with successful results, to generate the overexpression lines in L. major parasites; these lines allowed us to determine important implications of these proteins in the developmental of the parasites. Significant morphological alterations were observed together with a lower rate of growth, whose more drastic effect was better observed when the parasites were grown at 37ºC. On the other hand, the infective in vitro capacity of these mutant parasites was significantly affected, as well as their intracellular proliferation rate, regarding the wild type strain. Overall, this study describes the structural features of SCD6 and RBP42 proteins, and their in vitro and in vivo capacities to bind RNA. Proteomics data and cellular analysis point to a relevant implication of SCD6 and RBP42 proteins as regulators for a wide group of transcripts in Leishmania.Doctor en Ciencias BiológicasDoctorad

Caracterización molecular de los genes codificantes de la proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70) de Trypanosoma rangeli

Las proteínas de choque térmico son parte esencial en la supervivencia celular gracias a su función como moléculas protectoras del daño inducido por estrés y su papel biológico como chaperonas moleculares. Dada la importancia biológica de las proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70), se caracterizó el gen que codifica esta proteína en las cepas Tre y H14, representantes de los dos grandes grDoctor en Ciencias BiológicasDoctorad

Zoonosis, cambio climático y sociedad

La sociedad contemporánea se enfrenta a uno de los retos más grandes de la historia humana, el calentamiento global, mismo que acarrea enormes consecuencias, tales como los disturbios climáticos, así como los patrones de las enfermedades de origen animal transmisibles al hombre. Precisamente ante este escenario las instituciones educativas de nivel superior deben dar cumplimiento a su responsabilidad y ser las generadoras de alternativas de solución mediante el trabajo especializado de investigación; y para ello, la pesquisa científica es la mejor de las alternativas a nuestro alcance para comprender y encarar estos desafíos.Universidad Autónoma del Estado de México y Ediciones y Gráficos Eón, S.A. de C.V

Anuario FIS 1998-1999-2000

Introducción, Subvenciones concedidas en el año 1998, Proyectos de investigación concedidos en 1998, Becas de Formación en Investigación (BEFI)concedidas en 1998, Becas de Ampliación de Estudios (BAE)concedidas en 1998, Becas de Corta Duración (BECE)concedidas en 1998 Bolsas de Viaje concedidas en 1998, Reuniones Científicas subvencionadas en 1998, Publicaciones Científicas subvencionadas en 1998, Contratos de Investigadores concedidos en 1998, Subvenciones concedidas en el año 1999, Proyectos de investigación concedidos en 1999, Becas de Formación en Investigación (BEFI)concedidas en 1999 Becas de Ampliación de Estudios (BAE)concedidas en 1999, Becas de Corta Duración (BECE) concedidas en 1999, Bolsas de Viaje concedidas en 1999 Índice por beneficiario, Reuniones Científicas subvencionadas en 1999 Publicaciones Científicas subvencionadas en 1999, Contratos de Investigadores concedidos en 1999, Subvenciones concedidas en el año 2000, Proyectos de investigación concedidos en 2000, Becas de Formación en Investigación (BEFI)concedidas en 2000, Becas de Ampliación de Estudios (BAE)concedidas en 2000, Becas de Corta Duración (BECE)concedidas en 2000, Bolsas de Viaje concedidas en 2000, Reuniones Científicas subvencionadas en 2000, Contratos de Investigadores concedidos en 2000, Otras subvenciones gestionadas por otras unidades del Instituto de Salud Carlos III que en 2001 pasan a ser gestionadas por la Subdirección General de Investigación Sanitaria, Proyectos de investigación evaluativa, Becas del Instituto de Salud Carlos III Extramurales concedidas en 1998, Becas del Instituto de Salud Carlos III Extramurales concedidas en 1999, Becas del Instituto de Salud Carlos III Extramurales concedidas en 2000, Estructura territorial y por áreas de las ayudas concedidas y resultado de las acciones e Índice

Investigaciones sobre mosquitos de Argentina

Este libro se compone de seis secciones: 1. Taxonomía, 2. Distribución, 3. Ecología, 4. Eco-epidemiología de enfermedades transmitidas por mosquitos, 5. Control de poblaciones de mosquitos y 6. Aspectos culturales prevención y acción comunitaria. Cada sección fue coordinada por especialistas de cada temática. Los 28 capítulos que conforman el libro fueron escritos por investigadores provenientes de todas las regiones del país, quienes exponen los avances más recientes de cada área, y destacan y comentan los estudios realizados en Argentina. De este modo, cada capítulo ofrece al lector una visión realista de los avances que se han realizado en Argentina en torno a los mosquitos, su implicancia en la salud humana, y su control, tanto de las especies nativas como de las invasoras. En las primeras tres secciones se abordaron aspectos puramente biológicos, en la cuarta sección se integran los aspectos ecológicos con los epidemiológicos, en la quinta sección se aborda el control de los mosquitos vectores desde las técnicas químicas y biológicas. Debido a que la problemática del control de mosquitos no solo tiene una componente biológica sino también social, se incluyó la sexta sección, que trata sobre los aspectos culturales y las acciones a desarrollar por la comunidad. Esta sección invita a incursionar desde un enfoque diferente y necesario, a la concientización de la ciudadanía en el control de los mosquitos vectores. Como cierre, se presentan a modo de epílogo, las proyecciones de las investigaciones realizadas hasta el presente, y las necesidades a futuro, invitando a reflexionar y a debatir los caminos a tomar de aquí en más, además de incentivar a las nuevas generaciones de investigadores a continuar con las investigaciones e incursionar en nuevos enfoques de un mismo problema.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET

Libro del XVIII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología - APANAC 2021

Desde su fundación en 1985, APANAC ha sido clave en promover un espacio de comunicación y crecimiento para la comunidad científica en Panamá, a través de la promoción de sus logros, así como en la promoción ante el Estado de la necesidad de apoyar el desarrollo de la Ciencia como base para el crecimiento sostenible de nuestra sociedad. Así es como hace cerca de 25 años, APANAC juega un papel fundamental en la generación y promulgación de la Ley 13 de 1997 con la que se crea SENACYT. Igualmente, dentro de esta misión de desarrollo a la comunidad científica se ha logrado consolidar el Congreso que hoy se inaugura en su XVIII versión. Este Congreso en particular ha representado un reto muy importante, sobretodo por darse en medio de una pandemia global, con devastadoras consecuencias económicas, que ha puesto de manifiesto las profundas diferencias que aquejan a la sociedad panameña. Sin embargo, estas circunstancias, han hecho también evidente la importancia de la Ciencia y la Tecnología, reforzando la necesidad de que las políticas públicas, planes de Gobierno o bien las respuestas a las crisis, se hagan no sólo con base en evidencias científicas, sino también con una perspectiva interdisciplinaria. Es así como este Congreso tiene una relevancia única, dado que muestra la existencia en nuestro país de una masa crítica de científicos y académicos comprometidos en sus diferentes áreas de trabajo con el desarrollo de Panamá. La calidad de las conferencias, mesas redondas y simposios que se presentan en este XVIII Congreso es muestra de ello, sobretodo porque en su gran mayoría, son el producto de trabajos nacionales. Agradecemos a la SENACYT, así como a todas las Universidades e Institutos de Investigación Nacional por su apoyo y activa participación en este Congreso, a la Ciudad del Saber por su soporte logístico y a la Embajada del Estado de Israel en Panamá por su gestión en facilitar la participación de muchos de los prestigiosos expositores invitados